Подвижната фаза е еквивалентна на течната фаза на кръвта, и има различни неща, на които да обърнете внимание по време на употреба. Сред тях има някои „подводни камъни“, на които трябва да се обърне внимание.
01. Измерете pH на подвижната фаза след добавяне на органичен разтворител
Ако измервате pH с органична добавка, pH, което получавате, ще бъде различно от това преди добавянето на органичния разтворител. Най-важното обаче е да сте постоянни. Ако винаги измервате pH след добавяне на органичния разтворител, не забравяйте да посочите вашите стъпки в метода, който използвате, така че другите да следват същия метод. Този метод не е 100% точен, но поне ще поддържа метода последователен. Това може да е по-важно от получаването на точна pH стойност.
02. Не е използван буфер
Целта на буфера е да контролира рН и да предотвратява промяната му. Много други методи променят рН на подвижната фаза, което може да причини промени във времето на задържане, формата на пика и отговора на пика.
Мравчена киселина, TFA и др. не са буфери
03. Не се използва буфер в нормалния диапазон на рН
Всеки буфер има ширина на обхват от 2 pH единици, в рамките на които осигурява най-добра pH стабилност. Буферите извън този прозорец няма да осигурят ефективна устойчивост на промени в pH. Или използвайте буфер в правилния диапазон, или изберете буфер, който покрива диапазона на рН, от който се нуждаете.
04. Добавете буфер към органичния разтвор
Смесването на буферен разтвор с органична фаза най-вероятно ще доведе до утаяване на буфера. В много случаи, дори ако е имало валежи, те все още са трудни за откриване. Не забравяйте винаги да добавяте органичния разтвор към водната фаза, което може значително да намали шанса за буферно утаяване.
05. Смесете градиента на концентрация от 0% с помпа
Наличните днес помпи могат ефективно да смесват подвижни фази и да дегазират в линия, но не всеки, който използва вашия метод, ще има висококачествена помпа. Смесете A и B в един разтвор и го пуснете 100% вграден.
Например, 950 ml органична изходна смес може да се приготви чрез смесване с 50 ml вода. Предимството на това е, че може да намали променливостта между HPLC и да намали възможността за мехурчета и утаяване в системата. Заслужава да се отбележи, че съотношението на сместа на помпата е 95:5, което не означава, че времето за задържане на предварително смесената смес в бутилката също е 95:5.
06. Не се използва правилната модифицирана киселина (основа) за промяна на буфера
Използвайте само киселината или основата, която образува буферната сол, която използвате. Например, натриев фосфатен буфер трябва да се приготви само с фосфорна киселина или натриев хидроксид.
07. Не се посочва цялата информация за буфера в метода, като например добавяне на 5g отнатриев фосфат на 1000 мл вода.
Видът на буфера определя обхвата на pH, който може да бъде буфериран. Необходимата концентрация определя силата на буфера. 5 грама или безводен натриев фосфат и 5 грама мононатриев фосфат монохидрат имат различна сила на буфера.
08. Добавяне на органични разтворители преди проверка
Ако предишният метод използва буферен разтвор за базова линия B, а вашият метод използва органичен разтвор за базова линия B, можете да се надяваме, че буферът се утаява в тръбата на помпата и главата на помпата.
09. Повдигнете бутилката и изпразнете последната капка
Има голям шанс да нямате достатъчно подвижна фаза, за да завършите целия цикъл и пробата ви да изпуши. Освен възможността за изгаряне на помпената система и колоната, подвижната фаза ще се изпари напълно и подвижната фаза в горната част на бутилката ще се промени.
10. Използвайте ултразвукова дегазираща подвижна фаза
Най-важният момент е да се уверите, че всички буферни соли са разтворени, но това е най-лошият начин за дегазиране и бързо ще нагрее подвижната фаза, което ще доведе до изпаряване на органичните компоненти. За да си спестите ненужни проблеми по-късно, отделете пет минути, за да вакуумно филтрирате мобилната си фаза.
Време на публикуване: 27 август 2024 г