хроматографията, известна още като "хроматографски анализ", "хроматография", е метод за разделяне и анализ, който има много широк спектър от приложения в аналитичната химия, органичната химия, биохимията и други области.
Основателят на хроматографията е руският ботаник М. Цветтер.През 1906 г. руският ботаник Цветтер публикува резултатите от своя експеримент: за да отдели растителните пигменти, той изсипва екстракт от петролев етер, съдържащ растителни пигменти, в стъклена епруветка, съдържаща прах от калциев карбонат, и го елуира с петролев етер отгоре надолу.Тъй като различните пигменти имат различен капацитет на адсорбция върху повърхността на частиците на калциевия карбонат, с процеса на излугване различните пигменти се движат надолу с различни скорости, като по този начин образуват ивици с различни цветове.Пигментните компоненти бяха разделени.Той нарече този метод на разделяне хроматография.
Схематично представяне на експеримент за отделяне на пигменти от листни растения
С непрекъснатото развитие на методите за разделяне, все повече и повече безцветни вещества стават обект на разделяне, хроматографията също постепенно губи значението на "цвят", но името все още се използва днес.
Хроматографска класификация
Същността на хроматографията е процес, при който молекулите, които трябва да се разделят, се разделят и балансират между неподвижната фаза и подвижната фаза.Различните вещества се разпределят по различен начин между двете фази, което ги кара да се движат с различна скорост с подвижната фаза.С движението на подвижната фаза различните компоненти в сместа се разделят един от друг върху неподвижната фаза.В зависимост от механизма, той може да бъде разделен на различни категории.
1, съгласно класификацията на двуфазното агрегатно състояние
Подвижна фаза: Газова хроматография, течна хроматография, суперкритична флуидна хроматография
Стационарна фаза: газ-твърдо вещество, газ-течност;Течно-твърдо, течно-течно
2, според формата на класификация на стационарна фаза
Колонна хроматография: напълнена колонна хроматография, капилярна колонна хроматография, микронапълнена колонна хроматография, препаративна хроматография
Плоска хроматография: хартиена хроматография, тънкослойна хроматография, полимерна мембранна хроматография
3, класифицирани според механизма на разделяне
Адсорбционна хроматография: Различните компоненти се разделят според техния адсорбционен и десорбционен капацитет на адсорбентите
Разпределителна хроматография: Различните компоненти се разделят според тяхната разтворимост в разтворителя
Молекулярна ексклюзивна хроматография: според размера на молекулния размер на разделянето В йонообменна хроматография: различни компоненти на афинитета за разделяне на йонообменна смола
Афинитетна хроматография: Разделяне чрез наличието на специфичен афинитет между биологични макромолекули
Капилярна електрофореза: компонентите бяха разделени според разликите в подвижността и/или поведението на разделяне
Хиралната хроматография се използва за разделяне и анализ на хирални лекарства, които могат да бъдат разделени на три категории: метод с реагент за хирална дериватизация;Адитивен метод на хирална подвижна фаза;Метод за разделяне на хирална стационарна фаза
Основна терминология за хроматография
Кривите, получени чрез начертаване на сигналите за отговор на компонентите след откриване на хроматографско разделяне спрямо времето, се наричат хроматограми.
Базово ниво:При определени хроматографски условия кривата на сигнала, генериран, когато само подвижната фаза преминава през детекторната система, се нарича базова линия, както е показано на линията ot.Когато експерименталното състояние беше стабилно, базовата линия беше линия, успоредна на хоризонталната ос.Базовата линия отразява шума на инструмента, главно на детектора, във времето.
Височина на върха:вертикалното разстояние между хроматографската пикова точка и базовата линия, означено с h, както е показано на линията AB.
Ширина на региона:Ширината на областта на хроматографския пик е пряко свързана с ефективността на разделяне.Има три метода за описване на ширината на хроматографския пик: стандартно отклонение σ, ширина на пика W и FWHM W1/2.
Стандартно отклонение (σ):σ е половината разстояние между двете точки на инфлексия на кривата на нормалното разпределение, а стойността на σ показва степента на дисперсия на компонентите далеч от колоната.Колкото по-голяма е стойността на σ, толкова по-разпръснати са компонентите на отпадъчния поток и толкова по-лош е ефектът на разделяне.Обратно, компонентите на отпадъчния поток са концентрирани и ефектът на разделяне е добър.
Ширина на върха W:Пресечните точки от двете страни на хроматографския пик се използват като допирателни линии, а пресечната точка на базовата линия се нарича ширина на пика или ширина на базовата линия, която може да бъде изразена и като W, както е показано на фигура IJ.Съгласно принципа на нормалното разпределение, може да се докаже, че връзката между ширината на пика и стандартното отклонение е W=4σ.
W1/2:Ширината на пика на половината от височината на пика се нарича FWHM, както е показано за разстоянието на GH.W1/2=2,355σ, W=1,699W1/2.
W1/2, W се извличат от σ и се използват за изчисляване на пиковите площи в допълнение към измерването на ефекта на колоната.Измерването на FWHM е по-удобно и най-често използвано.
кратко обобщение
От хроматографската пикова изходяща крива могат да се постигнат следните цели:
a, Качественият анализ беше извършен въз основа на стойността на задържане на хроматографските пикове
b, количествен анализ въз основа на площта или пика на хроматографския пик
C. Ефективността на разделяне на колоната се оценява според стойността на задържане и ширината на пика на хроматографския пик
Формулата за изчисление, използвана в хроматографията
1. Стойност на задържане
Стойността на задържане е параметър, използван за описване на степента, до която даден компонент на пробата се задържа в колоната и се използва като индикатор за хроматографско характеризиране.Методът на неговото представяне е следният:
Време на задържане tR
Време на смърттаtM
Регулирайте времето на задържане tR'=tR-tM
(Общо време, прекарано в стационарна фаза)
Обем на задържане
VR=tR*F. (независимо от скоростта на подвижната фаза)
Мъртъв обем
VM=tM*Fc
(Пространството, което не е заето от стационарната фаза в пътя на потока от инжектора към детектора)
Регулирайте обема на задържане VR'=t'R*Fc
2. Относителна стойност на задържане
Относителната стойност на задържане, известна още като фактор на разделяне, съотношение на коефициента на разпределение или фактор на относителен капацитет, е съотношението на коригираното време на задържане (обем) на изпитвания компонент към коригираното време на задържане (обем) на стандарта при определени хроматографски условия.
Използвани са относителни стойности на задържане, за да се елиминира влиянието на определени работни условия, като скорост на потока и загуба на фиксация, върху стойностите на задържане.Стандартът в относителната стойност на задържане може да бъде компонент в тестваната проба или съединение, добавено изкуствено.
3. Индекс на задържане
Индексът на задържане е индексът на задържане на веществото i, което ще се тества във фиксиран разтвор X. Два n-алана са избрани като референтни вещества, единият от които има N въглеродно число, а другият има N+n.Тяхното коригирано време на задържане е съответно t 'r (N) и t 'r (N+n), така че коригираното време на задържане t 'r (i) на веществото i, което ще се тества, е точно между тях, т.е. t 'r (N).
Индексът на задържане може да се изчисли по следния начин.
4. Коефициент на капацитет (k)
При равновесие съотношението на масата на компонент в неподвижната фаза (s) към подвижната фаза (m), наречено фактор на капацитета.Формулата е следната:
5、Коефициент на разпределение (K) В равновесие съотношението на концентрацията на компонент в неподвижната фаза (s) към подвижната фаза (m), наречено коефициент на разпределение.Формулата е следната
Връзката между K и k:
Той отразява вида на колоната и нейния възел важни свойства на структурата
кратко обобщение
Връзка между стойността на задържане и фактора на капацитета и коефициента на разпределение:
Хроматографското разделяне се основава на разликата в способността за адсорбция или разтваряне на всеки компонент във фиксирана относителна проба, която може да бъде количествено изразена чрез размера на стойността на коефициента на разпределение K (или фактора на капацитет k).
Компонентите със силна способност за адсорбция или разтваряне имат голям коефициент на разпределение (или фактор на капацитет) и дълго време на задържане.Обратно, компонентите със слаба адсорбция или разтворимост имат малък коефициент на разпределение и кратко време на задържане.
Основна теория на хроматографията
1. Теория на тавата
(1) Изложена -- термодинамична теория
Всичко започна с модела на кулата, предложен от Мартин и Синдж.
Фракционираща колона: в тавата за няколко пъти на равновесие газ-течност, според точката на кипене на различното разделяне.
Колона: Компонентите са балансирани чрез множество разпределения между двете фази и разделени според различни коефициенти на разпределение.
(2) Хипотеза
(1) В колоната има много тарелки и компонентите могат бързо да достигнат равновесието на разпределение в рамките на интервала на тарелката (т.е. височината на тавата).
(2) Подвижната фаза навлиза в колоната не непрекъснато, а пулсиращо, т.е. всеки пасаж е обем на колоната.
(3) Когато пробата беше добавена към всяка колонна плоча, дифузията на пробата по оста на колоната може да бъде пренебрегната.
(4) Коефициентът на разпределение е еднакъв за всички тави, независимо от количеството на компонентите.Тоест коефициентът на разпределение е постоянен за всеки табан.
(3) Принцип
Принципна диаграма на теорията на тавата
Ако компонент с единица маса, а именно m=1 (например 1mg или 1μg), се добави към тава № 0 и след равновесие на разпределението, тъй като k=1, а именно ns=nm, nm=ns=0,5.
Когато обемът на плочата (lΔV) газ носител навлезе в плоча 0 под формата на пулсация, газът носител, съдържащ nm компонента в газовата фаза, се избутва към плоча 1. По това време компонентът ns в течната фаза на плоча 0 и nm компонентът в газовата фаза на плоча 1 ще бъде преразпределен между двете фази.Следователно, общото количество компоненти, съдържащи се в плоча 0, е 0,5, в която газовата и течната фази са всяка по 0,25, а общото количество, съдържащо се в плоча 1, също е 0,5.Газовата и течната фази също бяха 0,25.
Този процес се повтаря всеки път, когато в колоната се пулсира нов обемен газ-носител на плоча (вижте таблицата по-долу).
(4) Уравнение на хроматографската изходяща крива
σ е стандартното отклонение, е времето на задържане, C е концентрацията по всяко време,
C, е концентрацията на инжектиране, т.е. общото количество на компонентите (пикова площ А).
(5) параметри на ефективността на колоната
При постоянно tR, колкото по-малък е W или w 1/2 (т.е. по-тесният пик), толкова по-голям е броят на теоретичните плочи n, толкова по-малка е теоретичната височина на плочата и толкова по-висока е ефективността на разделяне на колоната.Същото важи и за ефективната теория tray neff.Следователно, теоретичният брой тарелки е индекс за оценка на ефективността на колоните.
(5)Характеристики и недостатъци
> Предимства
Теорията на тавата е полуемпирична и обяснява формата на кривата на изтичане
Процесите на разделяне и разделяне на компонентите са илюстрирани
Предложен е индекс за оценка на ефективността на колоната
> Ограничения
Компонентите не могат наистина да достигнат равновесието на разпределение в двете фази:
Надлъжната дифузия на компонентите в колоната не може да бъде пренебрегната:
Влиянието на различни кинетични фактори върху процеса на пренос на маса не е взето предвид.
Връзката между ефекта на колоната и скоростта на потока на подвижната фаза не може да бъде обяснена:
Не е ясно какви основни фактори влияят върху ефекта на колоната
Тези проблеми са решени задоволително в теорията на скоростта.
2. Теория на курса
През 1956 г. холандският учен VanDeemter et al.усвои концепцията за теорията на тавата и комбинира кинетичните фактори, влияещи върху височината на тавата, представи кинетичната теория на хроматографския процес - теория на скоростта и изведе уравнението на VanDeemter.Той разглежда хроматографския процес като динамичен неравновесен процес и изучава влиянието на кинетичните фактори върху разширяването на пика (т.е. ефект на колона).
По-късно Giddings и Snyder et al.предложи уравнението за скоростта на течната хроматография (а именно уравнението на Гидингс), базирано на уравнението на VanDeemter (по-късно наречено уравнение за скоростта на газовата хроматография) и според разликата в свойствата между течност и газ.
(1) Уравнение на Van Deemter
Където: H: е височината на дъската
A: коефициент на член на вихрова дифузия
B: коефициент на член на молекулна дифузия
C: коефициент на съпротивлението на пренос на маса
(2) Уравнение на Гидингс
Количествен и качествен анализ
(1) Качествен анализ
Качественият хроматографски анализ е за определяне на съединенията, представени от всеки хроматографски пик.Тъй като различните вещества имат определени стойности на задържане при определени хроматографски условия, стойността на задържане може да се използва като качествен показател.Различни хроматографски качествени методи понастоящем се основават на стойностите на задържане.
Различните вещества обаче могат да имат подобни или идентични стойности на задържане при едни и същи хроматографски условия, т.е. стойностите на задържане не са изключителни.По този начин е трудно да се характеризира напълно неизвестна проба само въз основа на стойностите на задържане.Ако въз основа на разбирането на източника, естеството и предназначението на пробата може да се направи предварителна преценка за състава на пробата и могат да се използват следните методи за определяне на съединението, представено от хроматографския пик.
1. Качествен контрол с помощта на чисти вещества
При определени хроматографски условия неизвестното има само определено време на задържане.Следователно неизвестното може да бъде идентифицирано качествено чрез сравняване на времето на задържане на известното чисто вещество при същите хроматографски условия с времето на задържане на неизвестното вещество.Ако двете са еднакви, неизвестното вещество може да е известно чисто вещество;В противен случай неизвестното не е чистото вещество.
Методът за контрол на чистото вещество е приложим само за неизвестно вещество, чийто състав е известен, чийто състав е относително прост и чието чисто вещество е известно.
2. Метод на относителната стойност на задържане
Относителната стойност на задържане α се отнася до корекцията между компонент i и референтни материали Съотношение на стойностите на задържане:
Променя се само с промяната на фиксатора и температурата на колоната и няма нищо общо с други работни условия.
При определена стационарна фаза и температура на колоната се измерват съответно коригираните стойности на задържане на компонент i и референтно вещество s и след това се изчисляват съгласно горната формула.Получените относителни стойности на задържане могат да бъдат качествено сравнени със съответните стойности в литературата.
3, добавяне на известни вещества за увеличаване на метода на височината на пика
Когато има много компоненти в неизвестната проба, получените хроматографски пикове са твърде плътни, за да бъдат лесно идентифицирани чрез горния метод, или когато неизвестната проба се използва само за анализ на определен елемент.
„Първо се прави хроматограма на неизвестна проба, а след това се получава допълнителна хроматограма чрез добавяне на известно вещество към неизвестната проба.“Компонентите с повишени пикови височини могат да бъдат известни за такива вещества.
4. Запазване на качествения метод на индекса
Индексът на задържане представлява поведението на задържане на вещества върху фиксатори и в момента е най-широко използваният и международно признат качествен индекс в GC.Той има предимствата на добра възпроизводимост, единен стандарт и малък температурен коефициент.
Индексът на задържане е свързан само със свойствата на неподвижната фаза и температурата на колоната, но не и с други експериментални условия.Неговата точност и възпроизводимост са отлични.Докато температурата на колоната е същата като тази на неподвижната фаза, литературната стойност може да се приложи за идентификация и не е необходимо да се използва чист материал за сравнение.
(2) Количествен анализ
Основа за хроматографско количествено определяне:
Задачата на количествения анализ е да се намерят стоте компонента в смесената проба
Дробно съдържание.Хроматографското количествено определяне се основава на следното: когато работните условия са постоянни, беше
Масата (или концентрацията) на измервания компонент се определя от отговорния сигнал, даден от детектора
Пропорционално е.а именно:
Основа за хроматографско количествено определяне:
Задачата на количествения анализ е да се намерят стоте компонента в смесената проба
Дробно съдържание.Хроматографското количествено определяне се основава на следното: когато работните условия са постоянни, беше
Масата (или концентрацията) на измервания компонент се определя от отговорния сигнал, даден от детектора
Пропорционално е.а именно:
1. Метод за измерване на площта на пика
Площта на пика е основните количествени данни, предоставени от хроматограмите, и точността на измерване на площта на пика пряко влияе върху количествените резултати.Бяха използвани различни методи за измерване за хроматографски пикове с различни форми на пикове.
Трудно е да се намери точната стойност на зимата в количествения анализ:
От една страна, поради трудността на точното измерване на абсолютния инжекционен обем: от друга страна
Площта на пика зависи от хроматографските условия и хроматографската лента трябва да се поддържа, когато стойността се измерва
Нито е възможно, нито е удобно да се прави същото.И дори ако можете да го направите правилно
Точната стойност, също и защото няма единен стандарт и не може да се прилага директно.
2. Количествен корекционен фактор
Дефиниция на количествен коригиращ фактор: количество компоненти, влизащи в детектора (m)
Съотношението на площта на неговия хроматографски пик (A) или височината на пика () е константа на пропорционалност (,
Константата на пропорционалност се нарича абсолютен коригиращ фактор за компонента.
Трудно е да се намери точната стойност на зимата в количествения анализ:
От една страна, поради трудността на точното измерване на абсолютния инжекционен обем: от друга страна
Площта на пика зависи от хроматографските условия и хроматографската лента трябва да се поддържа, когато стойността се измерва
Нито е възможно, нито е удобно да се прави същото.И дори ако можете да го направите правилно
Точната стойност, също и защото няма единен стандарт и не може да се прилага директно.
Тоест, относителният коефициент на корекция на компонент е компонентът и референтният материал s
Съотношението на абсолютните корекционни коефициенти.
Може да се види, че относителният коефициент на корекция е когато качеството на компонента спрямо стандарта.
Когато веществото s е равно, площта на пика на референтния материал е площта на пика на компонента
Многократни.Ако някой компонент има маса m и пикова площ A, тогава броят на f'A
Стойностите са равни на площта на пика на референтния материал с маса от.С други думи,
Чрез относителния коефициент на корекция пиковите площи на всеки компонент могат да бъдат разделени
Преобразува се в площта на пика на референтния материал, равна на неговата маса, след това съотношението
Стандартът е унифициран.Това е нормализираният метод за определяне на процента на всеки компонент
Основата на количеството.
Метод за получаване на относителен корекционен коефициент: стойностите на относителния корекционен коефициент се сравняват само със същността
Измерването е свързано със стандарта и вида на детектора, но с операционната лента
Няма значение.Следователно стойностите могат да бъдат извлечени от препратки в литературата.Ако текстът
Ако не можете да намерите желаната стойност в офертата, можете да я определите и сами.Метод на определяне
Метод: Определено количество от измерваното вещество, десет избрани референтни материали → се превръща в определена концентрация
Измерват се площите на хроматографските пикове А и As на двата компонента.
Това е формулата.
3. Метод на количествено изчисление
(1) Метод за нормализиране на площта
Сумата от съдържанието на всички фракции без пикове се изчислява като 100% за количествено определяне
Методът се нарича нормализиране.Формулата му за изчисление е следната:
Където P,% е процентното съдържание на тестваните компоненти;A1, A2... A n е компонент 1. Площта на пика на 1~n;f'1, f'2... f'n е относителният корекционен фактор за компоненти от 1 до n.
(2) външен стандартен метод
Методът за количествено сравнение между сигнала за реакция на компонента, който ще се тества в пробата, и чистия компонент, който ще се тества като контрола.
(3) Метод на вътрешния стандарт
Така нареченият вътрешен стандартен метод е метод, при който определено количество чисто вещество се добавя към стандартния разтвор на тестваното вещество и разтвора на пробата като вътрешен стандарт, след което се анализира и определя.
(3) стандартен метод на добавяне
Стандартният метод на добавяне, известен също като метод на вътрешно добавяне, е да се добави определено количество (△C)
Референтното вещество за изпитване беше добавено към разтвора на пробата, който трябва да се тества, и тестът беше добавен към анализа
Пикът на разтвора на пробата след веществото е по-висок от този на първоначалния разтвор на пробата
Увеличението на площта (△A) се използва за изчисляване на концентрацията на веществото в разтвора на пробата
Съдържание (Cx)
Където Ax е площта на пика на веществото, което трябва да се измери в оригиналната проба.
Време на публикуване: 27 март 2023 г