Течната хроматография е основният метод за тестване на съдържанието на всеки компонент и примеси в суровини, междинни продукти, препарати и опаковъчни материали, но много вещества нямат стандартни методи, на които да разчитат, така че е неизбежно да се разработят нови методи. При разработването на методи за течна фаза хроматографската колона е ядрото на течната хроматография, така че как да изберем подходяща хроматографска колона е от решаващо значение. В тази статия авторът ще обясни как да изберете колона за течна хроматография от три аспекта: общи идеи, съображения и обхват на приложение.
A. Общи идеи за избор на колони за течна хроматография
1. Оценете физичните и химичните свойства на аналита: като химическа структура, разтворимост, стабилност (като дали лесно се окислява/редуцира/хидролизира), киселинност и алкалност и т.н., особено химическата структура е ключът фактор при определяне на свойствата, като например конюгираната група има силна ултравиолетова абсорбция и силна флуоресценция;
2. Определете целта на анализа: дали се изисква високо разделяне, висока ефективност на колоната, кратко време за анализ, висока чувствителност, устойчивост на високо налягане, дълъг живот на колоната, ниска цена и т.н.;
- Изберете подходяща хроматографска колона: разберете състава, физичните и химичните свойства на хроматографския пълнител, като размер на частиците, размер на порите, температурен толеранс, рН толеранс, адсорбция на аналита и др.
- Съображения за избор на колони за течна хроматография
Тази глава ще обсъди факторите, които трябва да се имат предвид при избора на хроматографска колона от гледна точка на физичните и химичните свойства на самата хроматографска колона. 2.1 Пълнежна матрица
2.1.1 Матрица от силикагел Пълнежната матрица на повечето колони за течна хроматография е силикагел. Този тип пълнител има висока чистота, ниска цена, висока механична якост и е лесен за модифициране на групи (като фенилна връзка, амино връзка, циано връзка и т.н.), но стойността на pH и температурният диапазон, които толерира, са ограничени: Диапазонът на рН на повечето силикагелни матрични пълнители е от 2 до 8, но диапазонът на рН на специално модифицираните фази, свързани със силикагел, може да бъде широк от 1,5 до 10, а има и специално модифицирани фази, свързани със силикагел, които са стабилни при ниско рН, като Agilent ZORBAX RRHD stablebond-C18, който е стабилен при pH 1 до 8; горната температурна граница на матрицата от силикагел обикновено е 60 ℃, а някои хроматографски колони могат да понасят температура от 40 ℃ при високо pH.
2.1.2 Полимерна матрица Полимерните пълнители са предимно полистирен-дивинилбензен или полиметакрилат. Предимствата им са, че могат да понасят широк диапазон на рН – могат да се използват в диапазона от 1 до 14 и са по-устойчиви на високи температури (могат да достигнат над 80 °C). В сравнение с базираните на силициев диоксид C18 пълнители, този тип пълнител има по-силна хидрофобност и макропорестият полимер е много ефективен при разделянето на проби като протеини. Недостатъците му са, че ефективността на колоната е по-ниска и механичната якост е по-слаба от тази на пълнителите на основата на силициев диоксид. 2.2 Форма на частиците
Повечето съвременни HPLC пълнители са сферични частици, но понякога те са неправилни частици. Сферичните частици могат да осигурят по-ниско налягане в колоната, по-висока ефективност на колоната, стабилност и по-дълъг живот; когато се използват подвижни фази с висок вискозитет (като фосфорна киселина) или когато разтворът на пробата е вискозен, неправилните частици имат по-голяма специфична повърхност, което е по-благоприятно за пълното действие на двете фази и цената е относително ниска. 2.3 Размер на частиците
Колкото по-малък е размерът на частиците, толкова по-висока е ефективността на колоната и по-високото разделяне, но толкова по-лоша е устойчивостта на високо налягане. Най-често използваната колона е колоната с размер на частиците 5 μm; ако изискването за разделяне е високо, може да бъде избран пълнител от 1,5-3 μm, което е благоприятно за решаване на проблема с разделянето на някои сложни матрици и многокомпонентни проби. UPLC може да използва 1,5 μm пълнители; Пълнителите с размер на частиците от 10 μm или по-големи често се използват за полупрепаративни или препаративни колони. 2.4 Съдържание на въглерод
Съдържанието на въглерод се отнася до съотношението на свързаната фаза върху повърхността на силикагела, което е свързано със специфичната повърхност и покритието на свързаната фаза. Високото съдържание на въглерод осигурява висок капацитет на колоната и висока разделителна способност и често се използва за сложни проби, изискващи голямо разделяне, но поради дългото време на взаимодействие между двете фази, времето за анализ е дълго; хроматографските колони с ниско съдържание на въглерод имат по-кратко време за анализ и могат да покажат различни селективности и често се използват за прости проби, които изискват бърз анализ, и проби, които изискват условия на висока водна фаза. Обикновено въглеродното съдържание на C18 варира от 7% до 19%. 2.5 Размер на порите и специфична повърхност
HPLC адсорбционните среди са порести частици и повечето взаимодействия протичат в порите. Следователно молекулите трябва да влязат в порите, за да бъдат адсорбирани и разделени.
Размерът на порите и специфичната повърхност са две допълващи се концепции. Малкият размер на порите означава голяма специфична повърхност и обратно. Голямата специфична повърхност може да увеличи взаимодействието между молекулите на пробата и свързаните фази, да подобри задържането, да увеличи натоварването на пробата и капацитета на колоната и разделянето на сложни компоненти. Напълно порестите пълнители спадат към този тип пълнители. За тези с високи изисквания за разделяне се препоръчва избор на пълнители с голяма специфична повърхност; малката специфична повърхност може да намали обратното налягане, да подобри ефективността на колоната и да намали времето за равновесие, което е подходящо за градиентен анализ. Към този тип пълнители спадат пълнителите сърцевина-черупка. Предпоставката за осигуряване на разделяне се препоръчва да се избират пълнители с малка специфична повърхност за тези с високи изисквания за ефективност на анализа. 2.6 Обем на порите и механична якост
Обемът на порите, известен също като „обем на порите“, се отнася до размера на празния обем на единица частица. Може добре да отразява механичната якост на пълнителя. Механичната якост на пълнителите с голям обем на порите е малко по-слаба от тази на пълнителите с малък обем на порите. Пълнители с обем на порите по-малък или равен на 1,5 mL/g се използват най-вече за HPLC разделяне, докато пълнители с обем на порите по-голям от 1,5 mL/g се използват главно за хроматография с молекулярно изключване и хроматография с ниско налягане. 2.7 Скорост на ограничаване
Затварянето може да намали остатъчните пикове, причинени от взаимодействието между съединенията и откритите силанолни групи (като йонно свързване между алкални съединения и силанолни групи, ван дер Ваалсови сили и водородни връзки между киселинни съединения и силанолни групи), като по този начин подобрява ефективността на колоната и формата на пика . Незатворените свързани фази ще произведат различни селективности по отношение на затворените свързани фази, особено за полярни проби.
- Обхват на приложение на различни колони за течна хроматография
Тази глава ще опише обхвата на приложение на различни видове колони за течна хроматография в някои случаи.
3.1 Хроматографска колона C18 с обърната фаза
Колоната C18 е най-често използваната колона с обърната фаза, която може да изпълни тестовете за съдържание и примеси на повечето органични вещества и е приложима за средно полярни, слабо полярни и неполярни вещества. Типът и спецификацията на хроматографската колона C18 трябва да бъдат избрани в съответствие със специфичните изисквания за разделяне. Например, за вещества с високи изисквания за разделяне често се използват спецификации 5 μm*4,6 mm*250 mm; за вещества със сложни матрици за разделяне и подобна полярност могат да се използват спецификации 4 μm*4,6 mm*250 mm или по-малки размери на частиците. Например, авторът използва колона 3 μm*4,6 mm*250 mm за откриване на два генотоксични примеса в API на целекоксиб. Разделянето на двете вещества може да достигне 2,9, което е отлично. В допълнение, при предпоставката за осигуряване на разделяне, ако се изисква бърз анализ, често се избира къса колона от 10 mm или 15 mm. Например, когато авторът използва LC-MS/MS за откриване на генотоксичен примес в API на пиперахин фосфат, е използвана колона 3 μm*2,1 mm*100 mm. Разделянето между примеса и основния компонент беше 2,0 и откриването на проба може да бъде завършено за 5 минути. 3.2 Фенилова колона с обърната фаза
Фениловата колона също е вид колона с обърната фаза. Този тип колона има силна селективност за ароматни съединения. Ако реакцията на ароматните съединения, измерена с обикновена колона C18, е слаба, можете да помислите за замяна на фениловата колона. Например, когато правех целекоксиб API, реакцията на основния компонент, измерена от фениловата колона на същия производител и същата спецификация (всичките 5 μm*4,6 mm*250 mm) беше около 7 пъти по-голяма от тази на колоната C18. 3.3 Колона с нормална фаза
Като ефективно допълнение към колоната с обърната фаза, колоната с нормална фаза е подходяща за силно полярни съединения. Ако пикът все още е много бърз при елуиране с повече от 90% водна фаза в колоната с обърната фаза и дори близо до и се припокрива с пика на разтворителя, можете да обмислите замяна на колоната с нормална фаза. Този тип колона включва хилова колона, амино колона, циано колона и др.
3.3.1 Хилова колона Хиликовата колона обикновено вгражда хидрофилни групи в свързаната алкилова верига, за да подобри реакцията към полярни вещества. Този тип колона е подходяща за анализ на захарни вещества. Авторът използва този тип колона, когато прави съдържанието и свързаните вещества на ксилозата и нейните производни. Изомерите на ксилозното производно също могат да бъдат добре разделени;
3.3.2 Амино колона и циано колона Амино колона и циано колона се отнасят до въвеждането на амино и циано модификации съответно в края на свързаната алкилова верига, за да се подобри селективността за специални вещества: например амино колоната е добър избор за разделяне на захари, аминокиселини, основи и амиди; циано колоната има по-добра селективност при разделяне на хидрогенирани и нехидрогенирани структурно подобни вещества поради наличието на спрегнати връзки. Амино колоната и циано колоната често могат да се превключват между колона с нормална фаза и колона с обратна фаза, но честото превключване не се препоръчва. 3.4 Хирална колона
Хиралната колона, както подсказва името, е подходяща за разделяне и анализ на хирални съединения, особено в областта на фармацевтиката. Този тип колона може да се има предвид, когато конвенционалните колони с обратна фаза и нормална фаза не могат да постигнат разделяне на изомерите. Например, авторът използва 5 μm*4,6 mm*250 mm хирална колона, за да раздели двата изомера на 1,2-дифенилетилендиамин: (1S, 2S)-1,2-дифенилетилендиамин и (1R, 2R)-1,2 -дифенилетилендиамин и разделянето между двете достига около 2,0. Хиралните колони обаче са по-скъпи от други видове колони, обикновено 1W+/бр. Ако има нужда от такива колони, звеното трябва да направи достатъчен бюджет. 3.5 Йонообменна колона
Йонообменните колони са подходящи за разделяне и анализ на заредени йони, като йони, протеини, нуклеинови киселини и някои захарни вещества. Според вида на пълнителя те се разделят на катионобменни колони, анионобменни колони и силни катионобменни колони.
Катионообменните колони включват калциеви и водородни колони, които са подходящи главно за анализ на катионни вещества като аминокиселини. Например, авторът е използвал колони на основата на калций, когато е анализирал калциев глюконат и калциев ацетат в промивен разтвор. И двете вещества имаха силни реакции при λ=210n и степента на разделяне достигна 3,0; авторът използва колони на базата на водород, когато анализира вещества, свързани с глюкоза. Няколко основни свързани вещества – малтоза, малтотриоза и фруктоза – имаха висока чувствителност при диференциални детектори, с граница на откриване от едва 0,5 ppm и степен на разделяне 2,0-2,5.
Анионобменните колони са подходящи главно за анализ на анионни вещества като органични киселини и халогенни йони; силните катионобменни колони имат по-висок йонообменен капацитет и селективност и са подходящи за разделяне и анализ на сложни проби.
Горното е само въведение към типовете и диапазоните на приложение на няколко често срещани колони за течна хроматография, съчетано със собствения опит на автора. Има и други специални типове хроматографски колони в реални приложения, като хроматографски колони с големи пори, хроматографски колони с малки пори, колони за афинитетна хроматография, многомодови хроматографски колони, колони за течна хроматография със свръхвисока производителност (UHPLC), колони за суперкритична течна хроматография ( SFC) и др. Те играят важна роля в различни области. Конкретният тип хроматографска колона трябва да бъде избран според структурата и свойствата на пробата, изискванията за разделяне и други цели.
Време на публикуване: 14 юни 2024 г